RNA反转录合成cDNA第一链后是以什么状态存在的

1. RNA反转录合成cDNA第一链后是以什么状态存在的

RNA反转录合成cDNA第一链后是以双链的稳定形式存在的。
cDNA构建分为六个阶段：
阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链
阶段2：cDNA第二链的合成
阶段3：cDNA的甲基化
阶段4：接头或衔接子的连接
阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA
阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接
 cDNA 第一链的合成：
用亲和层析法得到 mRNA 后，根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是 mRNA 链很长时，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo （ dT ）仅与 mRNA 3' 端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，即形成双链DNA 分子。

2. DNA双链都可以转录mRNA么

不行，DNA的双链不能都用于转录mRNA，只有一条链可以。

DNA中有一条链的核苷酸顺序与mRNA相同，这条链称为编码链；把指导mRNA合成的，与mRNA互补配对的DNA链称为模板链或反义链。
只有模板链（反义链）才能用于转录mRNA。另外一条链（编码链）只用于DNA复制时的模板，只用于生成另外一条DNA链，不用于其他目的。

3. RNA逆转录生成的是双链DNA吗？为什么？

1、先是合成与RNA互补的DNA单链，然后DNA单链在DNA聚合酶的作用下继续合成为DNA双链。2、逆转录（reversetranscription）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。是RNA病毒的复制形式，需逆转录酶的催化。3、过程：先是以RNA为模版，在逆转录酶的作用下合成与其碱基互补配对的DNA单链，然后再以DNA单链为模版在DNA聚合酶的作用下继续合成双链DNA。4、逆转录是RNA病毒的复制形式，需要逆转录酶的催化。5、艾滋病病毒(HIV)就是一种典型的逆转录病毒。

4. RNA是如何反转录成cDNA的？过程和原理怎样？请教

rna不纯化做反转录，cdna容易降解.
是的，得到的是全体mrna的cdna的库。然后通过pcr手段获得需要的目的片段。但是实际操作过程中，由于mrna的降解，因此一次实验不可能得到全部的cdna,因此要重复1~2次，才能保证全部mrna被反转录为cdna.
核糖核酸（缩写为rna，即ribonucleic
acid），存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。rna由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。rna的碱基主要有4种，即a腺嘌呤、g鸟嘌呤、c胞嘧啶、u尿嘧啶，其中，u（尿嘧啶）取代了dna中的t。

5. DNA的两条链转录的mRNA都一样吗

第一，从理论上说，绝大多数情况下是不一致的，除非是回文结构。随便写一个例子：atgcct，它的互补链（注意是反向互补）应该是aggcat，明显序列不同，转录出的mrna不同，密码子不同，所以氨基酸不同的可能性很大。

第二，从实际上说，一个基因只存在于dna双链中的一条上，另一条链称这个基因的“无义链”（注意，不同基因所在的链可能不同，所以有义链和无义链一定针对某基因而言，不能说这一整条dna都是有义链或无义链），不进行转录和翻译，所以另一条链也就没有mrna，更没有氨基酸的问题。

6. 如何证明是否mRNA反转录cDNA第一链成功

 如何证明是否mRNA反转录cDNA第一链成功  如何证明是否mRNA反转录cDNA第一链成功  有反转录酶，可以以RNA为模版合成DNA。  这过程需要引物，根据mRNA有3‘polyA尾巴的特点,可以用oligo-dT作为引物，合成cDNA,这样可以自然去除非mRNA的RNA的转录。  也可以用随机引物去合成大量不同的cDNA。  如果要反转录特定的mRNA，就根据它设计特异性引物反转录，这样理论上只有目的cDNA产生。
  mRNA如何反转录成cDNA？  逆转录生成单链DNA和MRNA的杂交链 后来单链DNA在与游离的核苷酸合成双链
  mRNA反转录形成cDNA的步骤  mRNA反转录形成cDNA的步骤如下：  将mRNA置于PCR仪中，经过95度变性、72度延伸、Tm温度退火，来回30~35个回圈，最后4度就能得到反转录的cDNA。
  做RNA反转录，合成cDNA第一链时，不加DTT可以吗？  DTT 上的巯基可以保护逆转录所用酶的二硫键，增加蛋白稳定性。还是加吧~
  takara rr037a反转录试剂盒反转录出来的是单链cDNA还是双链cDNA？  是单链cDNA，想合成双链cDNA需要另外操作：
   
   一、cDNA第二链的合成: 
  1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中储存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
  20ul   10×DNA Polymerase I buffer
  6ul    10mM dNTP(自己配制)
  xul    dd H2O
  1ul    RNase H(2U/ul)
  10ul   DNA Polymerase I(10U/ul)
  总体系为200ul;
  2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
  3. 70℃灭活10分钟;
  4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
  5．取2ul二链产物，同储存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
  注：一链，二链的电泳图是 *** ear，且二链稍比一链大一些。
   二、双链cDNA末端补平: 
  1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
  6ul   10mM dNTP
  2ul   T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
  2ul   BSA(10mg/ml)
  2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
  3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
  4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
  5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
  6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
  7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
  8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
  注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
  PCR纯化试剂盒操作流程：
  1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。
  2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
  3．加入spin column中，13000rpm离心1min。
  4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
  5．13000rpm，再离心1min。
  6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
  7．13000rpm离心2min。
  8．加入30ul buffer EB，静置10min。
  9．13000rpm离心2min。
  10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
  mRNA反转录形成cDNA的过程是怎样的？  有反转录酶，可以以RNA为模版合成DNA。  这过程需要引物，根据mRNA有3‘polyA尾巴的特点，可以用oligo-dT作为引物，合成cDNA，这样可以自然去除非mRNA的RNA的转录。  也可以用随机引物去合成大量不同的cDNA。  如果要反转录特定的mRNA，就根据它设计特异性引物反转录，这样理论上只有目的cDNA产生
  cDNA是反转录法吗？人工合成包括反转录法  cDNA是互补DNA，它是由RNA转录来的，人工合成法包括反转录法和化学合成法
  mRNA反转录形成cDNA 大致分为哪些步骤  mRNA反转录形成cDNA 大致分为哪些步骤  有反转录酶，可以以RNA为模版合成DNA。  这过程需要引物，根据mRNA有3‘polyA尾巴的特点,可以用oligo-dT作为引物，合成cDNA,这样可以自然去除非mRNA的RNA的转录。  也可以用随机引物去合成大量不同的cDNA。  如果要反转录特定的mRNA，就根据它设计特异性引物反转录，这样理论上只有目的cDNA产生。
  
  
  先从细胞提取总RNA，然后根据大多数真核mRNA含有多聚腺嘌呤（polyadenylic acid ,polyA）尾的特点，用寡聚dT纤维素柱将mRNA分离出，以mRNA为模板，在多聚A尾上结合12－18个dT的寡聚dT片段，作为合适的起始引物，在逆转录酶作用下合成
   

7. 基因探针是DNA还是RNA，是单链还是双链

……作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：①应是单链，……
基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(dna或rna)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：①应是单链，若为双链，必须先行变性处理。②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基
基因探针
因的一部分；可以是dna本身，也可以是由之转录而来的rna。

8. DNA都是双链？RNA都是单链吗

DNA不都是双链，RNA不都是单链。有的DNA为单链，一般见于原核生物，如大肠杆菌噬菌体φX174、G4、M13等。RNA一般是单链线形分子；也有双链的如呼肠孤病毒RNA；环状单链的如类病毒RNA；1983年还发现了有支链的RNA分子。
DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。
DNA 分子结构中，两条多脱氧核苷酸链围绕一个共同的中心轴盘绕，构成双螺旋结构。脱氧核糖-磷酸链在螺旋结构的外面，碱基朝向里面。两条多脱氧核苷酸链反向互补，通过碱基间的氢键形成的碱基配对相连，形成相当稳定的组合。

扩展资料
由于DNA和RNA在化学组成与分子结构上存在一定的差别，因而对不同的染料有着不同的反应。所以，可以根据这一反应差异，来研究细胞中DNA与RNA的分布情况，RNA主要分布在细胞质中。
DNA和RNA两种核酸分子都是多聚体，但是它们的聚合程度有所不同。DNA聚合程度高，易于甲基绿结合；RNA聚合程度低易于吡罗红结合。
所以当吡罗红与甲基绿混在一起作为染料时吡罗红与核仁、细胞质中的RNA选择性结合，从而显示红色；甲基绿与染色质中的DNA选择性结合，从而显示绿色。综上所述，RNA对吡罗红的亲和力大，被染成红色；DNA对甲基绿的亲和力大，被染成绿色。
与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。
RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。
在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。