基因芯片技术是怎么检测的？

1. 基因芯片技术是怎么检测的？

“微处理器在本世纪使我们的经济结构发生了根本改变，给人类带来了巨大的财富，改变了我们的生活方式。然而，生物芯片给人类带来的影响可能会更大，它可能从根本上改变医学行为和我们的生活质量，从而改变世界的面貌 ”。

一、生物芯片与基因芯片 
  生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。生物芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等特点。按照生物芯片的制作技术，可以将生物芯片划分为微矩阵和原位合成芯片。鉴于生物芯片技术领域的飞速发展，美国科学促进会将生物芯片评为1998年的十大科技突破之一，认为生物芯片技术将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。
  目前,最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的“微阵列(microarray)”,也被称为基因芯片(Gene chip)DNA芯片(DNA chip)。按照载体上点的DNA种类的不同，基因芯片可分为寡核苷酸和cDNA两种芯片。按照基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片、毒理芯片等等。早在八十年代初期,Bains等人就用杂交的方法对固定在支持物上的短DNA片段进行序列测定。基因芯片技术从实验阶段走向工业化是得益于其他技术的引入，如激光共聚焦显微技术、探针固相原位合成技术与照相平板印刷技术的结合和双色荧光探针杂交系统的建立。90年代初期人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）和分子生物学相关学科的发展也为基因芯片技术的出现和发展提供了有利条件。1992年，Affymatrix公司Fodor领导的小组运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片。1995年，Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片。标志着基因芯片技术进入了广泛研究和应用的时期。

二、制备基因芯片的必要条件
  1、靶基因 用于芯片点样的是靶基因。靶基因可分为染色体DNA（或基因组DNA）、cDNA（或人工合成DNA）。目前，以cDNA的研究为主，因为cDNA是染色体上编码蛋白质的DNA序列，有医疗和其他领域的研究价值和商业价值。
  2、制备技术 基因芯片的制备综合了生命科学、化学染料、微电子技术、激光、统计学等领域的前沿技术，主要包括芯片的制备（选择点样仪和玻片、靶基因的扩增和固定）、杂交探针的制备（mRNA的抽提、mRNA的逆转录、PCR和探针荧光标记）、杂交条件的优化技术（杂交液、杂交条件和洗涤条件的选择）和数据分析技术。其中，基因芯片的制备主要依赖于微细加工（microfabrication）、自动化（automatism）及化学合成技术。通常比较典型的DNA芯片制备方法有3种：（1）原位合成法（in situ synthesis） 以Affymetrix公司开发的光引导原位合成法为代表（2）合成点样法 又根据是否与芯片的表面接触分为化学喷射法和接触式点涂法，分别以Incyte Pharmaceutical公司和Stanford大学为代表（3）压电法 通过使用4支分别装有A、T、G、C核苷的压电喷头在芯片上作原位DNA探针合成。

三、基因芯片技术简介
  基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果分析。
  1、芯片制备-目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。 
  2、样品制备-生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。
  3、杂交反应-杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。
  4、信号检测和结果分析-杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。 基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统（micro total analytical system）或称缩微芯片实验室（laboratory on a chip）。使用缩微芯片实验室，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。

四、基因芯片的应用及其商业价值
  目前，基因芯片技术应用领域主要有基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等。另外基因芯片在农业、食品监督、环境保护、司法鉴定等方面都将作出重大贡献。 基因芯片的飞速发展引起世界各国的广泛关注和重视。 
  鉴于基因芯片的巨大潜力和诱人的前景，基因芯片已成为各国学术界和工业界研究和开发的热点。尤其在美国，正处于人类基因组计划以来的第二次浪潮之中，美国总统克林顿在1998年1月的国情咨文中指出：“在未来的12年内，基因芯片将为我们一生的疾病预防指点迷津”。1998年6月29日美国宣布正式启动基因芯片计划，联合私人投资机构投入了20亿美元以上的研究经费。世界各国也开始加大投入，以基因芯片为核心的相关产业正在全球崛起，目前美国已有8家生物芯片公司股票上市，平均每年股票上涨75％，专家今统计：全球目前生物芯片工业产值为10亿美元左右，预计今后5年之内，生物芯片的市场销售可达到200亿美元以上。美国财富杂志载文：在20世纪科技史上有两件事影响深远，一是微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入每一个家庭；另一件事就是生物芯片它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。鉴于生物芯片技术具有巨大理论意义和实际价值，基因芯片研究在国内也有了很快的发展，例如，复旦大学、中科院上海冶金所、清华大学、联合基因有限公司、军事医学科学院、中科院上海细胞所等单位已在生物芯片技术方面取得了较大突破，相信不久将有我国生产的生物芯片产品投放市场。
  总之，以基因芯片为代表的生物芯片技术的深入研究和广泛应用，将对21世纪人类生活和健康产生极其深远的影响。

2. 如何设计实验检测基因突变的位点

如何设计实验检测基因突变的位点
基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。

3. 基因突变检测方法

　　基因突变检测方法：
 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。
异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。
突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。

4. 基因突变检测方法

基因突变检测方法：
1.
 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。
2.
异源双链分析法（HA）
HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。
3.
突变体富集PCR法（mutant-enriched
PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。

5. 应用基因芯片检测DNA序列的特定位点突变时,应如何设计？

做差一位排列组合探针设计即便是。
DNA分子结构中，两条多脱氧核苷酸链围绕一个共同的中心轴盘绕，构成双螺旋结构。脱氧核糖－磷酸链在螺旋结构的外面，碱基朝向里面。两条多脱氧核苷酸链反向互补，通过碱基间的氢键形成的碱基配对相连，形成相当稳定的组合。
脱氧核糖核酸（DNA）是生物细胞内携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息的一种核酸，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。
DNA中的核苷酸中碱基的排列顺序构成了遗传信息。该遗传信息可以通过转录过程形成RNA，然后其中的mRNA通过翻译产生多肽，形成蛋白质。

在细胞分裂之前，DNA复制过程复制了遗传信息，这避免了在不同细胞世代之间的转变中遗传信息的丢失。在真核生物中，DNA存在于细胞核内称为染色体的结构中。
在没有细胞核的其它生物中，DNA要么存在于染色体中要么存在于其它组织（细菌有单环双链DNA分子，而病毒有DNA或RNA基因组）。

6. 基因突变检测方法

　　基因突变检测方法：
 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。
异源双链分析法（HA）
HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。
突变体富集PCR法（mutant-enriched
PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。

7. 基因芯片技术

1   技术的基本步骤
    1.1  基因芯片的制备
  目前基因芯片的制备主要采用三种方法：即光蚀刻合成法，压电印刷法，点样法。
    1.1.1  光蚀刻合成法  是最初使用的一种方法，其主要过程是：在固相支持物上偶联带有可感光保护基团X的羟基，汞光有选择地照射到固相支持物，去掉可感光保护基团X,使羟基成为有功能的自由羟基，与加入的带X的核苷酸偶联，第一个反应物被嫁接到目标位置上。随着反应的重复，链不断地延伸，当所需的寡核苷酸链合成完后，对反应基板进行无遮板的汞光普照，去除所有X，即可得到所多方面的寡核苷酸阵列。这样，光照模式和反应物的加入顺序决定了合成产物的序列以及在基板上的位置。该法可以合成30个碱基左右，其优点在于精确性高，缺点是制造可感光保护剂价格较高昂贵。该法由美国的Affymetrix公司首先开发采用，目前该公司已开发成功能同时检测6500个已知人类基因的DNA芯片。
    1.1.2  电压印刷法  其原理类拟于喷墨打印机，打印机头上的墨盒有四个，分别装有四种不同的碱基，打印机头在方阵上移动，并将带有某种碱基的试剂滴到基板表面，然后固定，经过洗脱和去保护后，就可连上新的核苷酸，使寡核苷酸链延伸。该法采用的技术原理与传统的DNA固相合成相一致。压电印刷法可以合成40-50个碱基，此法效率高但工艺不太成熟，目前该法主要由美国的Incyte Pharmaceuticals公司采用。
    1.1.3  点样法  即预先合成寡核苷酸，肽核苷酸或分离得到cDNA，再通过点样机直接将其点到芯片上。寡核苷酸或肽核苷酸的合成主要是通过多孔玻璃合成法。肽核苷酸虽然在制备上比较复杂，但是它与DNA探针相比，由于PNA与DNA结合的复合物更加稳定和特异，因而更加有利于单碱基错配基因的检测。严自某一细胞的cDNA必须进行预处理，纯化，扩增以及分类，然后再利用机械手把它们准确地固定在基板的相应位置上，为了保证cDNA芯片检测的准确性，在制备cDNA芯片以前必须提高低表达基因cDNA的丰度，降低高表达基因cDNA的丰度。点样法的优点在于成本低、速度快，但缺点是构成方阵的寡核苷酸或cDNA片段需事先纯化。目前采用该法的公司最多，有英国的Brax Genomics Limited公司，美国的Hyseq,Molecular Dynamics,Nanogen等多家公司。
    1.2  样品的制备 
　　生物样品成分往往比较复杂，所以在与芯片接触前，必须对样品先进行处理。为了提高结果的准确性，来自血液或组织中的DNA/mRNA样本须先行扩增，然后再被荧光素或同位素标记成为探针。
    1.3  杂交
　　影响杂交的因素很多，但主要是时间，温度及缓冲液的盐浓度。如果是表达检测，需要长历时，低温和高盐条件的较严谨性杂交。而如果是突变检测，需要短历时，高温和低盐条件高严谨性杂交。总之，杂交条件的选择要根据芯片上核酸片段的长短及其本身的用途来定。
    1.4  杂交图谱的检测和读出 
　　目前最为常用的是激光共聚焦荧光检测系统，其原理主要是与芯片发生杂交的探针上的荧光被激发后经过棱镜刚好能通过共聚集小孔，而能被探测器检测到，而芯片之外的其它荧光信号则不能被探测器检测到，检测到的荧光信号通过计算机处理后就可直接读出杂交图谱，此法灵敏度和精确度较高，但是扫描所需时间较长。另一种检测系统采用CCD摄像原理，它虽然灵敏度和精确度较低，但所需的扫描时间较短，因而更适用于临床诊断。此外，近年来还发展了多种检测方法，如质谱法，化学发光法，光导纤维法等多种方法，其中最有前途的是质谱法。
Taton等发明了一种新的芯片检测操作方案——Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probe,该法使用了Au和Ag两种金属离子来标记寡核苷酸探针，另外使用普通的平台扫描仪检测。他们通过研究发现使用金属离子标记探针与基板进行杂交时，其退火温度曲线与使用传统的荧光标记探针的完全不同。这种不同使得杂交时其单核苷酸错配的几率比传统的荧光标记探针法低3倍以上。另外这种金属离子标记探针在与芯杂交时会互相交联形成一种较大颗粒的网络结构。由于以上两个原因使用该法进行DNA芯片检测时其灵敏度比使用荧光标记法高两个数量级。

8. 基因芯片技术

基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术就是顺应这一科学发展要求的产物，它的出现为解决此类问题提供了光辉的前景。该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于 400 ）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术 ，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片 等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，与计算机的电子芯片十分相似，所以被称为基因芯片。基因芯片主要用于基因检测工作 。 早在八十年代， Bains W. 等人就将短的 DNA 片断固定到支持物上，借助杂交方式进行序列测定。但基因芯片从实验室走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结  基因芯片
合以及激光共聚焦显微技术的引入。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且借助  基因芯片
激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。正如电子管电路向晶体管电路和集成电路发展是所经历的那样，核酸杂交技术的集成化也已经和正在使分子生物学技术发生着一场革命。现在全世界已有十多家公司专门从事基因芯片的研究和开发工作，且已有较为成型的产品和设备问世。主要代表为美国 Affymetrix 公司。该公司聚集有多位计算机、数学和分子生物学专家，其每年的研究经费在一千万美元以上，且已历时六七年之久，拥有多项专利。产品即将或已有部分投放市场，产生的社会效益和经济效益令人瞻目。 　　基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（Southern Blotting 和 Northern Blotting 等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。