如何获得cDNA？

2024-05-04 17:40

1. 如何获得cDNA？

cDNA的获取方法：
1.用亲和层析法得到
mRNA
后，根据
mRNA
分子的
3'
端有
poly
(A)
尾结构的原理，用
12~20
个核苷酸长的
oligo
与纯化的
mRNA
混合，
oligo
（
dT
）会与
poly
(A)
结合作为反转录酶的引物，随机引物法合成的产物也是
RNA-DNA
的杂交体。把
cDNA
克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的
RNA
转变成
DNA
链，即形成双链
DNA
分子。
2.利用
cDNA
第一链的
3'
末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，用这种方法合成的双链
cDNA
在一端有一个发夹环，可以用单链特异的
S1
核酸酶切去。新合成的
DNA
存在切口，用
DNA
连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的
DNA
链。
RNase
H
法优于
S1
核酸酶法，它能获得包括
mRNA
5'
端全部或绝大部分的更长顺序
cDNA
分子。
cDNA简介：
为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary
DNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶(反转录酶)的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA(基因组DNA，genomic
DNA)不同而无内含子;相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，与exon序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。

如何获得cDNA？

2. 求教cDNA制备的一般方法

参考：http://baike.baidu.com/view/60324.htm
一、制备用于克隆cDNA的mRNA
       1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 
    2.磁珠法分离mRNA
       注意：一般需要做mRNA完整性的检测（检查mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力、mRNA分子的大小等）；如果用于制备cDNA文库则还需要检测mRNA在细胞中的丰度。
二、cDNA第一链的合成
    1、oligo(dT)引导的DNA合成法: 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链. 
      2、随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) : 
  根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始. 
三、cDNA第二链的合成
  1、自身引导合成法: 
  单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链. 
  缺 点: 
  在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子. 
    2、置换合成法 
  原 理: 
  以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链. 
  优点:a)合成cDNA的效率高 
  b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化 
  c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA 
  3、引物-衔接头法

3. cDNA是干什么用的

cDNA 互补脱氧核糖核酸

为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA，genomic DNA）不同而无内含子；相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，与exon序列、先导序列以及续序列等一起反映出mRNA结构。cDNA同样可以被克隆。

cDNA是干什么用的

4. cDNA文库的cDNA

cDNA双链合成1. Superscipt II—RT合成第一链:1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入xul mRNA(大约500ng)1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)11-x ul RNase-free water（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）2. 混匀后,70℃反应10分钟;3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:4ul 5×first strand buffer2ul 0.1M DTT1ul 10mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.2. cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):20ul 10×DNA Polymerase I buffer6ul 10mM dNTP(自己配制)xul dd H2O1ul RNase H(2U/ul)10ul DNA Polymerase I(10U/ul)总体系为200ul;2. 混匀后,16℃反应2.5小时;3. 70℃灭活10分钟;4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。3. 双链cDNA末端补平1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):6ul 10mM dNTP2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)2ul BSA(10mg/ml)2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。PCR纯化试剂盒操作流程：1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。3．加入spin column中，13000rpm离心1min。4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。5．13000rpm，再离心1min。6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。7．13000rpm离心2min。8．加入30ul buffer EB，静置10min。9．13000rpm离心2min。10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。4 EcoR I adaptor 加接1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:1.2ul 10×Ligase Buffer1ul 10mM rATP1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:1ul 10×Ligase Buffer1ul 10mM rATP6ul dd H2O1ul T4 PNK(10U/ul)3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;4. 稍微离心使反应物集中至管底;5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:4ul Xho 10×Buffer2ul BSA5ul ddH2O8ul Xho I (10U/ul)6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。6.胶回收cDNA1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。3．电泳50V；1hr4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬10． 离心并去上清（同操作8）11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。注意事项：1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。2．胶回收时电压要稳定。 第一链的合成oligo(dT)引导的DNA合成法:利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.缺 陷:因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始. 第二链的合成第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.缺 点:在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.自身引导法合成双链cDNA 原 理:以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.优点:a)合成cDNA的效率高b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA3,引物-衔接头法

5. 如何用已有的cDNA，做出相应的蛋白质？请写出详细的操作步骤，谢谢

可以利用基因工程技术进行蛋白质表达。
一个完整的基因克隆过程可以用分、切、接、转、筛五字概括。
分：即分离出感兴趣的外源基因----目的基因，其来源途径有：PCR技术，化学合成法，酶促合成cDNA，制备的基因组DNA。其中最常用的是PCR技术。
由于外源DNA片段离开染色体是不能复制的，就需要将外源DNA连到复制子上，外源DNA则可作为复制子的一部分在受体DNA中复制。这种复制子即基因载体。
载体（vector）是指能够携带外源基因进入宿主细胞的DNA分子。载体应具备以下条件：1.带有复制子（DNA聚合酶识别位点）能在宿主细胞内携带外源基因一同进行复制。2.载体分子上应具有单一限制酶切位点，以供外源基因的插入，一般将几个单一限制性酶切位点构建在载体的一个部位构成多克隆酶切位点（Multiple Cloning Site,MCS）。3.具有筛选标志，即载体分子上能赋予受体细胞一定特性的特定基因顺序，例如抗药基因，编码酶的基因等，用于筛选含此载体的受体细胞。4.对于表达型载体还应具备能使外源基因表达的完整的转录单位。
载体按功能分类可分为克隆载体和表达性载体。前者以复制外源基因为目的，后者即能复制外源基因又能表达外源基因产物。按载体来源分类可以分为质粒载体，噬菌体DNA，病毒DNA，酵母人工染色体等，质粒是最常用的载体。
质粒（plasmid）是存在与于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环的DNA分子，能赋予细菌某些特性的辅助遗传单位。其性质：1.根据质粒在一个细胞周期内产生拷贝的数量，可将质粒分为严谨型（低拷贝，复制1—2次）和松弛型（高拷贝，复制10—200次）。2.不相容性：是指同一类的不同个体质粒不能在同一个细菌中稳定共存，细菌经分裂后，细菌中只留下拷贝数较高的质粒，例如R1和R2两种抗药性质粒同属于一类，因此不能共同存在于同一细菌中。但不同类群的质粒可以在一个细菌中共存。常用的质粒有pBR322，pUC18/19等。

如何用已有的cDNA，做出相应的蛋白质？请写出详细的操作步骤，谢谢

6. 什么是cDNA？

cDNA（全称complementary DNA），是一种互补脱氧核糖核酸。与mRNA链互补的单链DNA，以其mRNA为模板，在适当引物的存在下，由mRNA与DNA进行一定条件下合成的，就是cDNA。
【cDNA定义】
为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA，genomic DNA）不同而无内含子；相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，与exon序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。cDNA同样可以被克隆。
【DNA与cDNA的区别】
DNA指的是生物体的主要遗传物质,单体脱氧核糖核酸聚合而成的聚合体,内部有内含子等结构.cDNA是由与RNA链互补的单链DNA,以其RNA为模板,在适当引物的存在下,由RNA与DNA经过反转录过程而成反转录的DNA,其内部无内含子等结构,基因克隆中利于在原核生物中表达.

7. 什么是cDNA？

cDNA（全称complementary DNA），是一种互补脱氧核糖核酸。与mRNA链互补的单链DNA，以其mRNA为模板，在适当引物的存在下，由mRNA与DNA进行一定条件下合成的，就是cDNA。
【cDNA定义】
为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA，genomic DNA）不同而无内含子；相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，与exon序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。cDNA同样可以被克隆。
【DNA与cDNA的区别】
DNA指的是生物体的主要遗传物质,单体脱氧核糖核酸聚合而成的聚合体,内部有内含子等结构.cDNA是由与RNA链互补的单链DNA,以其RNA为模板,在适当引物的存在下,由RNA与DNA经过反转录过程而成反转录的DNA,其内部无内含子等结构,基因克隆中利于在原核生物中表达.

什么是cDNA？

8. 什么是cDNA？

cDNA（全称complementary DNA），是一种互补脱氧核糖核酸。与mRNA链互补的单链DNA，以其mRNA为模板，在适当引物的存在下，由mRNA与DNA进行一定条件下合成的，就是cDNA。
【cDNA定义】
为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA，genomic DNA）不同而无内含子；相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，与exon序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。cDNA同样可以被克隆。
【DNA与cDNA的区别】
DNA指的是生物体的主要遗传物质,单体脱氧核糖核酸聚合而成的聚合体,内部有内含子等结构.cDNA是由与RNA链互补的单链DNA,以其RNA为模板,在适当引物的存在下,由RNA与DNA经过反转录过程而成反转录的DNA,其内部无内含子等结构,基因克隆中利于在原核生物中表达.
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